(논문)중탄산나트륨 섭취가 유방암의 전이를 억제한다

쥐를 이용한 실험에서 중탄산나트륨 치료법이 유방암의 전이를 억제하였다는 논문을 아래와 같이 인용하고 초록과 결론 그리고 그림 위주로 번역하였습니다.

(번역이 원문과 상이하거나 매끄럽지 못한 부분은 댓글로 남겨 주시면 감사하겠습니다)

원문 : http://cancerres.aacrjournals.org/content/69/6/2260.short

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Bicarbonate Increases Tumor pH and Inhibits Spontaneous Metastases

중탄산나트륨은 종양 pH를 증가시키고 자발적 전이를 억제합니다

Ian F. Robey,1 Brenda K. Baggett,1 Nathaniel D. Kirkpatrick,1 Denise J. Roe,1 Julie Dosescu,2 Bonnie F. Sloane,2 Arig Ibrahim Hashim,3 David L. Morse,3 Natarajan Raghunand,1 Robert A. Gatenby,3 and Robert J. Gillies3

1 Arizona Cancer Center, University of Arizona, Tucson, Arizona; 2 Department of Pharmacology, Wayne State University, Detroit, Michigan; and 3H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, Tampa, Florida

Abstract

The external pH of solid tumors is acidic as a consequence of increased metabolism of glucose and poor perfusion. Acid pH has been shown to stimulate tumor cell invasion and metastasis in vitro and in cells before tail vein injection in vivo. 

고형 종양의 외부 pH는 글루코스의 증가된 대사와 약해진 관류의 결과로써 산성입니다. 산성 pH는 생체 외부에서 그리고 생체내에서 꼬리 정맥 주사 전의 세포들에서 종양 세포 침윤과 전이를 자극시키는 것으로 보여져 왔습니다.

The present study investigates whether inhibition of this tumor acidity will reduce the incidence of in vivo metastases. Here, we show that oral NaHCO3 selectively increased the pH of tumors and reduced the formation of spontaneous metastases in mouse models of metastatic breast cancer. 

현재의 연구는 이 종양 산도의 억제가 생체내에서 전이 발생을 감소시키는지를 조사하는 것입니다. 여기서 우리는 중탄산나트륨(NaHCO3)을 섭취켜 종양의 pH를 선택적으로 증가시켰고 전이된 유방암의 쥐 모델에서 자발적 전이의 형성을 감소시켰음을 보였습니다.

This treatment regimen was shown to significantly increase the extracellular pH, but not the intracellular pH, of tumors by 31P magnetic resonance spectroscopy and the export of acid from growing tumors by fluorescence microscopy of tumors grown in window chambers. 

이 치료 영역은 31P 핵자기공명법으로 종양들의 새포내 pH가 아닌 세포외 pH를 상당하게 증가시키고, window chamber에서 종양의 형광 현미경검사법으로 성장하는 종양들로부터 산을 배출하는 것으로 보였습니다.

NaHCO3 therapy also reduced the rate of lymph node involvement, yet did not affect the levels of circulating tumor cells, suggesting that reduced organ metastases were not due to increased intravasation. In contrast, NaHCO3 therapy significantly reduced the formation of hepatic metastases following intrasplenic injection, suggesting that it did inhibit extravasation and colonization. 

중탄산나트륨(NaHCO3) 치료법은 또한 림프절 병발 비율을 감소시켰고 아직 순환하는 종양 세포를의 수준에는 영향을 주지 않았습니다. 이것은 감소되어진 장기 전이가 증가한 intravasation으로 인한 것이 아님을 나타냅니다. 반대로 중탄산나트륨(NaHCO3) 치료법은 intrasplenic 주사를 따르는 간 전이의 형성을 크게 감소시킵니다. 이것은 extravasation이나 집락화를 억제하는 것으로 보여집니다.

In tail vein injections of alternative cancer models, bicarbonate had mixed results, inhibiting the formation of metastases from PC3M prostate cancer cells, but not those of B16 melanoma. Although the mechanism of this therapy is not known with certainty, low pH was shown to increase the release of active cathepsin B, an important matrix remodeling protease. [Cancer Res 2009;69(6):2260–8]

대체 암 모델의 꼬리 정맥 주사에서 중탄산나트륨은 혼재된 결과를 갖습니다. PC3M 전립선 암세포들로부터 멜라린의 그것과는 다른 전이의 형성을 억제합니다. 비록 이 치료법의 메커니즘이 확실히 알려지지 않았을지라도 낮은 pH는 단백질분해효소를 재구성하는 중요한 모체가 되는 활성화된 카텝신 B의 분비를 증가시키는 것으로 보여집니다.

Figure 1. Effect of NaHCO3 on metastases and survival. MDA-MB-231 were obtained from American Type Culture Collection and maintained in growth media (DMEM/F-12 supplemented with 10% FBS) at 37jC with 5% CO2 in a humidified atmosphere. These cells were stably transfected with expression vectors for hygromycin-resistant pcDNA3.1/LacZ (Invitrogen). These h-gal–labeled MDA-MB-231 cells (107), suspended in 0.2 mL of 0.8% sterile saline, were injected s.c. into the left inguinal mammary fat pads of 6-wk-old female SCID mice. Mice (n = 8) were started on drinking water (ad libitum ) supplemented with 200 mmol/L NaHCO3 at 6 d postinjection and maintained along with untreated animals (n = 8). After 30 d of primary tumor growth, the animals were sacrificed and the h-gal–positive lung lesions were counted and sized after staining, as shown in A. Mean lesion diameters (P < 0.0001) and frequencies (P = 0.0342) were significantly different between the two groups as determined by two-tailed unpaired t test with Welch’s correction for unequal variances. In a repeat of this experiment, 106 h-gal-MDA-MB-231 cells were injected into inguinal mammary fat pads, and control (n = 9) and NaHCO3-treated (n = 15) animals were maintained for 60 d before sacrifice. In this experiment, lung images were analyzed using ImagePro Plus to determine the metastatic tumor burden by counting the number of h-gal–positive pixels per animal. B, numbers of lung lesions per animal following 60 d of growth in the presence of NaHCO3 in drinking water. The frequency of lesions per animal in the NaHCO3-treated mice was compared with that in untreated controls by unpaired t test (P = 0.0004). In a third experiment, MDA-MB-231 cells were stably transfected to express neomycin-resistant pcDNA3/EGFP (a gift from Peter Ratcliffe, Oxford University, Oxford, United Kingdom). MDA-MB-231/eGFP cells (6.5 106) were injected into inguinal mammary fat pads of animals that were randomized into bicarbonate and control groups (n = 12 per group) 6 d postinoculation. Tumors were allowed to grow for 5 to 6 wk (to a volume of f600 mm3), at which time they were surgically removed. If the primary regrew (as was the case in 9 of 24 animals), it was resected again. Animals were monitored biweekly and maintained on bicarbonate or water until they evidenced a lymph node lesion >300 mm3 in size, at which time they were sacrificed and necropsied by examination with a fluorescence dissecting scope. Data from this experiment are plotted as a Kaplan-Meier survival curve (C). The difference in the survival curve for the bicarbonate versus control animals was tested using the log-rank test (P = 0.027).

그림 1. 전이와 생존의 경우에 중탄산나트륨(NaHCO3)의 효과. 그림 1C에서 암을 유발시킨 쥐에게 30일간 1차적으로 암을 증식하게 하고 그 이후로 발생하는 전이암을 비교하여 대조군(물)보다 중탄산나트륨 투약군이 현저하게 생존하고 있음을 보여주고 있습니다. 이는 중탄산나트륨이 암세포 주변의 산성 상태를 중화시키기 때문입니다. 그림 1B는 6일간 중탄산나트륨을 투여한 결과 물만 투여한 대조군과의 쥐 한마리당 전이암의 300mm^3 내에 암세포 개수의 차이를 보인 것입니다. 대조군의 평균은 382개인 반해 중탄산나트륨의 투여군은 평균 74개입니다.

Figure 2. Lung metastases. Images were obtained at time of sacrifice from individual (numbered) mice in control and bicarbonate groups of the experiment shown in Fig. 1C. At time of necropsy, organ and lymph node green fluorescent tumor metastases from necropsies were detected by the Illumatool Bright Light System (LT-9500) using a 470 nm/40 nm excitation filter (Lightools Research) and imaged using a Stereomaster 4 dissecting microscope (Fisher Scientific) with mounted DC290 Zoom digital camera (Eastman Kodak). Images were captured at the same focal plane in the presence of 480-nm excitation and >490-nm filtered emission with an exposure time of 4 s for GFP images and 1/10 s for white-light illumination. Image data were analyzed with ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) by segmenting the green channel and counting total positive pixels per field.

그림 2. 폐 전이. 오른쪽이 중탄산나트륨의 투약군으로 폐 전이암이 현저히 억제되고 있음을 보여주고 있습니다.

Figure 3. Metastases and cathepsin B activity. A, at time of sacrifice, animals in the survival experiment shown in Fig. 1C were necropsied and metastases were quantified by fluorescence. Images were captured as described in Fig. 1C and fluorescence was quantified following RGB segmentation using ImageJ analysis software. Columns, average fluorescence pixel densities (fluorescence intensities area) for lymph nodes, visceral organs, mesentery, and lungs; bars, SE. AUF, arbitrary units of fluorescence. B, red fluorescent protein–expressing MDA-MB-231 tumor cells were incubated at low and high pH values for 4 d, and then overnight in 0.2% serum media, followed by assessment of pericellular and intracellular cathepsin B activity in live cells via a ‘‘real time assay’’, as described in Materials and Methods.

그림 3. 전이와 카텝신 B의 활동. 암은 전이할 때 타 조직를 파괴시켜 정지시켜야 하는데, 이를 위한 암은 조직을 파괴시키는 카텝신 B라는 단백질분해효소를 필요로 합니다. 이 효소는 산성 상태에서만 Lysosome에서 분비되어 조직의 파괴 작업이 가능한데 중탄산나트륨을 투여하면 카텝신 B가 현저히 억제된다는 것입니다.

Figure 4. The effect of NaHCO3 treatment on tumor pH. All in vivo measurements were done at 4.7 Ton a Bruker Biospec magnetic resonance imaging spectrometer equipped with a 14 G/cm self-shielded gradient insert, using volume excitation and home-built solenoid coils for reception. Image-guided volume-selective 31P magnetic resonance spectra of tumors in anesthetized mice were acquired as described in ref. 14. The pHe and pHi were measured from the chemical shifts of exogenous 3-aminopropylphosphonate and endogenous inorganic phosphate, respectively (17). For spectroscopy of tumors, 0.4 mL of 0.24 mol/L 3-aminopropylphosphonate was administered i.p. to mice a few minutes before anesthetization. Following anesthetization, a further 0.4 mL of 3-aminopropylphosphonate was injected i.p., and the mouse prepared for 31P MRS as before. This figure illustrates representative 31P magnetic resonance spectra from control (solid ) and NaHCO3-treated (dotted) MDA-MB-231 tumor xenografts. 3-APP, 3-aminopropylphosphonate; Pi, endogenous inorganic phosphate; PME, phosphomonoesters; NTP, nucleoside triphosphate. Inset, columns, average values for tumor pHi (P = 0.89) and pHe (P = 0.01) in the absence and presence of bicarbonate treatment (n = 6 mice each); bars, SE. Details of the acquisition and processing parameters are provided in Materials and Methods.

그림 4. 종양 pH에서 중탄산나트륨(NaHCO3) 치료의 효과. 중탄산나트륨을 오래기간 투여해도 새포 내외의 전해질 밀 산도의 교란은 없었다는 것입니다. 물을 투여한 대조군과 동일한 생리상태를 유지합니다. 본 실험에서는 인산계 완충제 물질(3-APP, PME, α-NTP, β-NTP, γ-NTP)을 가하여 비교하였습니다.

Figure 5. Microscopic pH gradients in window chambers. Tumors were inoculated into window chamber as described in Materials and Methods. pHe was measured following injection of SNARF-1 free acid by excitation with a He/Ne laser at 543 nm and emissions were collected in channel 1 with a 595/50-nm bandpass and in channel 2 with a 640-nm-long pass filter. Confocal images were converted to .tif format using ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/); respective background images were subtracted from each fluorescence image (red channel, blue channel); and image was then smoothed with a 2 2 kernel. The two images were then divided, subsequently removing zeros and not-a-numbers (NANs), creating a ratiometric image. The in vitro pH calibration was then applied to every pixel in the ratiometric image. Regions of interest were drawn around the tumor, the proximal peritumor region, and the distal ‘‘normal’’ region, and the mean pHe was calculated in these regions. The spatial pH distribution was calculated by drawing an intensity profile (5 pixels wide) from the center of the tumor out to the edge of the window chamber. These profiles were drawn in four orthogonal radial directions, originating from the tumor centroid. The pH profiles were then aligned so that they coincided at the tumor margin using the GFP image to determine the tumor rim. Representative pHe images are shown for untreated (A) and bicarbonate-treated (B) mice (10 field of view, 12.5 mm). Red lines, region of interest of tumor, defined by GFP images, shown in Supplementary Fig. S2. C, merged confocal image of tumor (white) surrounded by a labeled microvascular network (green). Radial lines, directions along which pHe values were measured. D, least-square fit across all directions and all tumors showing pHe distributions along radial lines for control and bicarbonate-treated tumors. ‘‘0’’ is centroid of tumor, and vertical line indicates tumor edge.

그림 5. window chamber에서 미세 pH 기울기.

Conclusions

The above data have shown that oral bicarbonate therapy significantly reduced the incidence of metastases in experimental models of breast and prostate cancer and that the effect seems to be primarily on distal (i.e., colonization), rather than proximal (i.e., intravasation), processes. It is not known whether bicarbonate is exerting its effects by decreasing survival of circulating tumor cells (although the numbers are not affected) or by inhibiting colonization at the metastatic site. 

위의 데이터에서 중탄산나트륨을 섭취하는 치료법은 유방암과 전립선암의 실험 모델에서 전이 발생을 크게 감소시키고, 그 효과는 근거리(즉, intravasation) 프로세스보다는 먼 곳(즉, 집락형성)이 우선인것 처럼 보여집니다. 중탄산나트륨이 순환하는 종양 세포들의 생존을 감소시키는 것으로 (숫자에는 영향을 주지 않더라도) 혹은 전이한 곳에서 집락형성을 억제하는 것으로 작용하는지는 알려지지 않았습니다.

Increases in pHe significantly reduced the release of a lysosomal protease, cathepsin B. Medically, the idea of treating cancer through p.o. administration of buffers is attractive but tethered to caveats. Reaction diffusion models show that the effect of bicarbonate on the pHe gradient will be graded with dose and that, at the current dose of 200 mmol/L, is not saturating. This dose translates to an intake of f1.5 Amol/h/g of whole mouse. By comparison, the acid production rate of tumors can be f100 Amol/h/g of tumor weight (45). Thus, these doses of NaHCO3 may be able to counteract the acid load of a 15-mg tumor, which translates to f105 cells or a 1-mm3 micrometastasis. 

pHe를 상당히 증가시키는 것은 lysosomal 단백질분해효소, 카텝신 B의 분비를 감소시켰습니다. 의학적으로 p.o. 완충제 투여를 통해서 암을 치료하는 아이디어는 매력적이지만 금기시 되어왔습니다. 반응 확산 모델은 pHe 기울기에 중탄산나트륨의 효과는 도즈로 평가되고 200 mmol/L의 현재 도즈에서 그 효과는 포화되지 않는다는 것입니다. 이 도즈는 전체 쥐의 f1.5 Amol/h/g의 섭취로 말할 수 있습니다. 그러므로 중탄산나트륨의 이들 도스는 15-mg 종양의 산 부하를 중화시키는 것이 가능할지도 모릅니다. 이것은 f105 세포들이나 혹은 1-mm3의 미세전이로 바꿔말할 수 있습니다.

The effectiveness of this therapy will be reduced with larger tumors (25). It is somewhat surprising that this incomplete effect had such a dramatic effect on metastases. Another concern is that bicarbonate, with an effective pKa of 6.24, would seem to be poorly suited as an alkalinizing buffer; thus, it is possible that better pHe control and more dramatic antimetastatic effects will be observed with a higher pKa buffer. However, it remains possible that this effect may be specific for buffers in the bicarbonate/CO2 family through involvement of carbonic anhydrase activity, which is important to pH regulation in tumors (46). Notwithstanding these concerns, however, the dramatic effect of bicarbonate therapy on the formation of breast cancer metastases in this model system warrants further investigation.

이 치료법의 효과는 큰 종양에 대해서는 감소될 것입니다. 이 불충분한 효과가 전이에 그렇게 엄청난 효과를 가진다는 것이 다소 놀랄만한 일인 것입니다. 또 다른 관심은 효과적인 6.24 pKa와 함께 중탄산나트륨은 완충제를 알칼리화하는 것으로서 빈약하지만 적합하게 보여질 수 있다는 것입니다; 그러므로 더 좋은 pHe 제어와 좀 더 획기적인 항전이효과는 높은 pKa 완충제로 관측될 수 있다는 가능성입니다. 이 효과는 탄산 탈수 작용을 이용하여 중탄산염/CO2 패밀리에 완충제를 위한 특별한 것일 수 있기에 가능성을 남겨둡니다, 탄산 탈수 작용은 종양에 pH를 정상화하는 데에 중요하다는 것입니다. 이러한 점들에도 불구하고 그러나 이 모델에서 유방암 전이에 중탄산나트륨 치료법의 엄청난 효과는 향후 연구를 보증할 것입니다.

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편집자 주)

위 논문에서는 중탄산나트륨 섭취로 산성화된 암종양의 주변이 중화되어 카텝신 B가 억제되고 따라서 전이가 억제된다는 내용입니다. 즉, 중탄산나트륨이 인체, 특히 암종양 주변의 pH가 균형을 이루도록 하는 데에 효과가 있다는 것입니다(중탄산나트륨이 알칼리로 항종양 효과를 가짐). 하지만 종양학자인 시몬치니 박사(http://www.curenaturalicancro.com)의 의견은 pH는 중요한 요소가 아니고 중탄산나트륨이 오직 곰팡이를 죽인다는 것입니다.

칸디다에 공격당한 인체의 기관은 결합조직이 세포고생산을 통해 기관의 방어 작용으로써 침범한 균의 집단을 감싸려 시도하는데, 이는 인체의 면역계가 일단 진균군락을 탐지해내면 더 커지기전에 제거하려는 노력을 하게되고 면역시스템에 장애가 있어 불가능해지면 인체는 군락 주위에 캡슐을 만드는 생물학적 반응을 유발하여 결국 자기주위에 일종의 컨테이너(암종양)를 만들게 된다는 것입니다.

시몬치니 박사가 그동안 임상에서 치료한 암종양은 전이를 억제하는 항종양 효과가 아닌 중탄산나트륨으로 곰팡이를 제거했기 때문이며 다른 알칼리 제품 등으로는 이런 곰팡이를 제거할 수 없다는 것입니다.